Возможности использования бактериологического исследования при глазных заболеваниях ограничены пределами доступности патологического очага. При расположении его в заднем отрезке глаза получить материал для исследования часто очень Трудно и возможность бактериологической диагностики в таких случаях, естественно, исключается. Основная область применения бактериологической диагностики в глазной практике — это заболевания наружного отдела глаза, а также проникающие ранения, при которых материал для исследования может быть получен во время хирургической обработки раны или при извлечении инородного тела. Вообще надо заметить, что при оперативных вмешательствах круг возможностей для получения бактериологического материала значительно расширяется.

Получение материала для исследования

Для получения материала из конъюнктивального мешка пользуются платиновой петлей (при ее отсутствии можно использовать петлю, изготовленную из нити спирали электроплитки, или другой инструмент (стеклянная палочка, шпатель и т. п.), которую предварительно стерилизуют прокаливанием в пламени спиртовой горелки. Оттянув нижнее веко, остывшей петлей захватывают комочек конъюнктивального отделяемого из глубины нижнего свода. При этом необходимо избегать прикосновения петли к коже и краям век, чтобы не занести в материал постороннюю микрофлору. Брать материал желательно до начала лечения и в утренние часы, когда отделяемое бывает более обильным. При отсутствии слизи и гноя (например, при исследовании здоровой конъюнктивы перед операциями) следует использовать слезную жидкость или слегка поскоблить поверхность соединительной оболочки (по Линднеру). Но лучше в таких случаях применить методику Элыннига: впустить в конъюнктивальный мешок из пастеровской пипетки одну каплю стерильного физиологического раствора или бульона и через несколько секунд отсосать эту каплю.

По тем же общим правилам получают материал из слезного мешка, выдавливая его содержимое, и с края века при язвенном блефарите, сняв предварительно корочку с язвы.

Большая осторожность требуется при взятии материала с роговой оболочки, особенно при наличии ползучей язвы роговицы. Петлю (или другой тупой инструмент) следует направлять косо к поверхности язвы и брать материал из прогрессирующего края ее. При этом необходима анестезия (3 капли 1% дикаина) и фиксация глазного яблока.

В качестве материала для исследования при проникающих ранениях глаза можно использовать отделяемое раны (если оно имеется), захватив его петлей или марлевым тампоном, пунктат передней камеры или извлеченное инородное тело, которое помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора. После встряхивания пробирки раствор используют для исследования.

Из передней камеры материал для исследования может быть получен с режущего инструмента во время парацентеза или посредством пункции. После анестезии роговицы (3 капли 1% раствора дикаина) и фиксации глазного яблока косо у лимба вкалывают иглу шприца, вводят ее в переднюю камеру (осторожно, не ранить радужную оболочку и капсулу хрусталика!) и отсасывают 0,3 мл содержимого передней камеры.

При эндофтальмите может возникнуть потребность в получении материала из стекловидного тела. Пункция глазного яблока проводится после анестезии (1 мл 2% раствора новокаина под конъюнктиву) острой и с достаточно широким просветом иглой, вкалываемой ближе к экватору. Отсасывается 0,3-0,5 мл внутриглазного содержимого.

Полученный материал подвергается изучению с целью выявления микроба и определения его вида (микробиологический диагноз). Материал может изучаться:

1. на предметном стекле (бактериоскопический метод);
2. в посевах (собственно бактериологический метод);
3. в эксперименте на животном (биологический метод).

Бактериоскопический метод

может быть использован в условиях любого глазного стационара при наличии несложного лабораторного оборудования и некоторых реактивов.

Для этого необходимо иметь следующее:

1. металлическую петлю;
2. чистые предметные стекла (на чистом стекле капля воды расплывается, а не принимает шаровидную форму);
3. ванночку с подставками для предметных стекол (стеклянные палочки или толстая медная проволока);
4. дистиллированную воду;
5. спирт;
6. пинцет;
7. фильтровальную бумагу;
8. раствор Люголя (йода 1 г, йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 300 мл);
9. растворы красок (лучше в склянках, закрытых пипетками с резиновыми баллончиками).

Для очистки новые стекла кипятят в 1% растворе соды (можно использовать золу), а затем промывают водой, слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, помещают на 1-2 часа в серную кислоту, после чего кипятят в растворе соды, промывают водой и опускают в 96° спирт. Хранят стекла либо в спирте, либо, вытерев спирт, сухими, в банках с притертой пробкой.

Наиболее употребительные краски: карболовый фуксин Циля (фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта 96° 10 мл, глицерина — несколько капель, дистиллированной воды 100 мл). Для окраски фуксин Циля обычно разводят дистиллированной водой в 10 раз (разведенный, или водный фуксин). Метиленовая синька (метиленовой синьки 10 г, спирта 96° 100 мл). Из нее готовят щелочную синьку Леффлера (спиртового раствора синьки 30 мл, 1% калийной или натриевой щелочи 1 мл, дистиллированной воды 100 мл). Карболовый генцианвиолет (готовится так же, как карболовый фуксин Циля).

Микробов изучают либо в живом виде (способы «раздавленной» и «висячей» капли), либо убитыми (в окрашенном препарате). Исследование в живом виде в основном выявляет способность микробов к активному движению, тогда как окрашенные препараты позволяют хорошо изучить их морфологию.

Различают простые способы окраски, когда обычно употребляется одна краска, и сложные способы окраски, выявляющие некоторые особенности физико-химического строения микробной клетки и имеющие поэтому дифференциально-диагностическое значение.

Техника приготовления окрашенных препаратов сводится к следующему. Материал наносят на чистое предметное стекло и равномерно распределяют по поверхности в виде кружка или овала. Мазок должен быть достаточно тонким. При наличии густого гноя следует предварительно нанести на предметное стекло одну каплю дистиллированной воды и размешать материал в этой капле. Мазок высушивают на воздухе. Стекло с высушенным препаратом берут за края большим и указательным пальцами мазком кверху и фиксируют троекратным проведением через пламя спиртовой горелки (на границе светлой и темной его части). При достаточной фиксации ощущается легкое жжение в пальцах. Зафиксированный мазок окрашивают. Готовят несколько препаратов, по меньшей мере два, один из которых окрашивают простым способом (метиленовая синька Леффлера, разведенный фуксин Циля), другой — по способу Грама.

Окрашивание по Леффлеру:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор синьки Леффлера на 3-5 минут;
2. препарат промывают дистиллированной водой и высушивают.

Окрашивание по Граму:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты;
2. сливают краску, снимают бумажку и, не промывая водой, наливают яа препарат люголевский раствор на 1 минуту; при этом мазок чернеет;
3. сливают люголевский раствор и обесцвечивают мазок спиртом (лучше путем погружения препарата в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек);
4. тщательно промывают водой;
5. заливают мазок разведенным фуксином на 1-2 минуты;
6. сливают краску, промывают препарат водой и высушивают.

Удобный способ Грама в модификации Синева, который предложил пользоваться заранее приготовленными кусочками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генцианвиолета и высушенной. На мазок предварительно наносят 2-3 капли воды и затем кладут эти кусочки бумаги. Дальше поступают, как описано выше.

Микроскопию мазков производят с иммерсионным объективом. При окраске по Леффлеру все микробы окрашиваются в синий цвет; при окраске по Граму — либо в сине-фиолетовый (грамположительные микробы), либо в красный цвет (грамотрицательные микробы).

Ограниченное число микробов, участвующих в заболеваниях наружного отдела глаза, и их характерные морфологические признаки нередко позволяют поставить правильный микробиологический диагноз уже с помощью одного только бактериоскопического исследования.

Бактериологический метод

становится необходимым в тех случаях, когда изучение в мазках оказывается недостаточным для установления вида микроба или возникает потребность в определении чувствительности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам.

Отсылая за подробным ознакомлением с бактериологическим методом к специальным руководствам по микробиологии, остановимся здесь лишь на принципах этого метода. Первый этап работы сводится к выделению отдельных видов микробов, т. е. к получению чистых культур. Для этого прибегают к механическому разобщению материала при посеве и к использованию сред, наиболее пригодных для развития предполагаемых возбудителей (элективные среды). Путем пересева отдельных колоний, выросших на среде, получают чистую культуру, которую исследуют под микроскопом (готовят мазки) и пересевают на дифференциально-диагностические среды для изучения биохимических свойств возбудителя.

Высокая требовательность большинства патогенных для глаза микробов в условиях культивирования обусловила преимущественное применение для их выделения элективных сред, содержащих нативный белок. Таковы, например, среда Эльшнига (одна часть лошадиной сыворотки или асцитической жидкости и две части бульона), свернутая сыворотка Леффлера (три части сыворотки и одна часть бульона с 1% пептона, 0,5% NaCl и 1% виноградного сахара), кровяной агар Левенталя (агар и 5-10% дефибринированной крови).

Что касается определения чувствительности микробов к антибиотикам, то наиболее простой способ такого определения заключается в использовании специально изготовляемых промышленностью дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных растворами антибиотиков и высушенных в вакууме. Материал для исследования (гной, пунктат, извлеченное инородное тело) помещают в стерильную пробирку с физиологическим раствором (1,5-2 мл). После встряхивания жидкость выливают в чашки Петри, лучше в две — одну с сахарным, другую с кровяным агаром — и покачиванием равномерно распределяют по поверхности среды. Затем на поверхность агара накладывают диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашек. Чашки ставят в термостат (37°) и на следующий день по величине зоны задержки роста вокруг дисков судят о степени чувствительности микроба к испытуемым антибиотикам. Отсутствие зоны задержки роста указывает на нечувствительность микроба к данному антибиотику.

Биологический метод

в глазной практике применяется только в тех случаях, когда при затрудненной диагностике токсигенное свойство может оказаться решающим в определении вида микроба (например, при дифференциальной диагностике дифтерийной палочки и палочки ксероза).

Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаза

В настоящее время специальное изучение вирусов, в том числе вируса трахомы (рис. 77), осуществляется с помощью культивирования их в культурах тканей (куриный эмбрион, асцит-карцинома мышей и др.) и электронной микроскопии.

Рис. 77. Клеточные включения при трахоме.

В клинической практике для диагностики трахомы применяется метод цитологического изучения соскоба конъюнктивы на наличие или отсутствие телец (включений) Провачека—Гальберштедтера. Для этого тупым скальпелем или краем предметного стекла соскабливают эпителиальный покров конъюнктивы (без крови), который наносят тонким слоем на предметное стекло, в течение 5 минут подсушивают на воздухе и фиксируют путем опускания на 15-20 минут в стаканчик с метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый эфир и абсолютный спирт в равном количестве). Окраску производят в течение 3-4 часов свежеприготовленным раствором краски Романовского—Гимза (из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем препарат промывают текучей водой, подсушивают на воздухе и исследуют под микроскопом. При этом ядра эпителиальных клеток оказываются окрашенными в розовый цвет, протоплазма — в светло-синий, включения — в синий, сине-фиолетовый цвет (рис. 77). Последние представляются в виде кокковидных образований, расположенных среди мелкозернистой массы, и признаются носителями трахоматозного вируса. Они чаще обнаруживаются в свежих случаях нелеченой трахомы, но могут встречаться и при паратрахомных конъюнктивитах.

Исследования последних лет выявили новую форму контагиозного вирусного заболевания глаз — эпидемический кератоконъюнктивит, а цитологическое изучение конъюнктивального соскоба при этом заболевании позволило обнаружить в эпителиальных клетках своеобразные включения, совершенно отличные от телец Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошинская).

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.

В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.

На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.

Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.

Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.

С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.

Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.

ЗАНЯТИЕ № 4

ТЕМА: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ) МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы

Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.

Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.

Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.

Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.

Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.

Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.

Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.

Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.

Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Свойства, используемые для идентификации выделенных культур.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Бактериологический метод (этапы):

1 1-й этап выделения чистой культуры аэробных бактерий: А) Микроскопия патологического материала.

Окраска мазков из патологического материала по Граму. Зарисовка препарата.

Посев патологического материала бактериологической петлей на пластинчатый мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Классификация питательных сред (указать области применения)

1. По консистенции: жидкие (мясо- пептонный бульон, желчный, сахарный бульон), плотные (2- 3% агара) и полужидкие (0,15- 0,7 % агара) среды.

2. По происхождению: естественные - из молока, мяса. яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и др продуктов; искусственные – 1) натуральные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов, универсальный источник азота и углерода - пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).2) синтетические c точным химическим составом Сотона для микобактерий, 199 для клеток.

3. По составу: простые питательные среды (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА) и с ложные (КА = МПА +5- 10% крови животных)

4. По назначению:

А) Общего назначения - универсальные, предназначенные для культивирования любых микроорганизмов (МПА,КА)

Б) Специальные для выращивания микроорганизмов не растущих на универсальных средах, дифференциации видов и избирательного выделения отдельных видов микроорганизмов:

элективные (селективные) для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих – (солевой агар для стафилококков).

дифференциально-диагностические (ДДС) -среды, позволяющие различать виды бактерий по ферментативной активности; Они с одержат: 1) универсальную питательную среду (МПА, КА); 2)дифферецирующий фактор - химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.3) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды Эндо, Плоскирева, Гисса и другие).

дифференциально-селективные (ДС) - среды, позволяющие выделять бактерии определенного вида по их физиологическим особенностям и дифференцировать от других видов по ферментативной активности Они содержат: 1) МПА 2) элективный химический субстрат, препятствующий росту других видов бактерий . 3)дифферецирующий фактор - субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба;) 4.) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды ЖСА для стафилококков, ВСА для сальмонелл, Плоскирева для шигелл и сальмонелл).

В) Обогащения среды для размножения и накопления бактерий определенного вида в клиническом материале (кровь в 20% желчном бульоне =сальмонеллы, отделяемое зева в 10 % сывороточном+ 2 % теллурита = коринебактерии.)

Г) Транспортные среды для забора и доставки (консервации) клинического материала =48 часов (Среда Амиеса –полужидкий агар+уголь активированный).)

Питательные среды (примеры):

Среда Эндо Тип среды дифференциально-диагностическая для энтеробактерий Питательная основа МПА Дифференцирующий фактор лактоза 1% Индикатор основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Е.с oli разлагают лактозу до кислоты –колонии красные с металлическим блеском, патогенные бесцветные;

Солевой агар Тип среды элективная для выделения стафилококков Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%

Среда Плоскирева Тип среды дифференциально-селективная для энтеробактерий

Питательная основа МПА Элективный фактор соли желчных кислот Дифференцирующий фактор лактоза

Индикатор нейтральный красный

Желточно-солевой агар Тип среды дифференциально-селективная для S . aureus _

Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%

Дифференцирующий фактор яичный желток

Индикатор нет

2 2 этап бактериологического метода исследования (выделение чистой культуры):

А) Изучение изолированных колоний (эшерихий, стафилококка) на пластинчатом МПА.

Б) Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).

В) Пересев изолированных колоний на скошенный МПА для накопления чистой культуры.

3 Выделение чистой культуры анаэробных бактерий: посев суспензии почвы на среду Китта-Тароцци для выделения патогенных клостридий

Среда Китт- Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина

Методы создания анаэробиоза:

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%), предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой

2. Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов – метод Фортнера).

Среда Китт - Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

4. Смешанный - используют несколько разных подходов.

Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. В настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является химический метод со специальными пакетами, действующими по принципу поглощения атмосферного кислорода в герметически закрытых емкостях .

Среда Вильсона-Блера (пробирки,чашки):

Питательная основа МПА Дыхательный субстрат глюкоза

Редуцирующий фактор сульфит натрия и двуххлористое железо сульфит-натрия Na 2 SO 3 → Na 2 S

Для среды Вильсона - Блера базой является агар с добавлением глюкозы , Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид - аниона , который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии , появляются в глубине агарового столбика .

Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности): (пробирки):

Питательная основа МПБ Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор тиогликолят натрия

Индикатор резазурин

Глюкозо-кровяной агар Цейсслера: (чашки): Питательная основа МПА, кровь

Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор гемоглобин

Термин «анаэробы» ввел Луи Пастер , открывший в 1861 году бактерии маслянокислого брожения .

А Лекция 3 Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий .

Физиология микроорганизмов включает:

типы питания;

типы дыхания;

культивирование (условия, среды, характер и скорость роста);

биохимическую активность;

изменчивость;

выделение биологически активных веществ, токсинов и других факторов патогенности;

чувствительность к антибиотикам, бактериофагам, бактериоцинам;

другие биологические свойства.

Метаболизм бактерий – совокупность физико-химических процессов (химических превращений и реакций), направленных на воспроизводство структур и обеспечение жизненных функций микробной клетки, таких как:

рост и размножение;

отложение резервного пищевого материала;

транспорт питательных веществ в микробную клетку;

выделение продуктов метаболизма (токсинов, ферментов, антибиотиков и других биологически активных веществ);

движение;

спорообразование;

адгезия на чувствительных рецепторах клеток хозяина и проникновение в них;

различных адаптивных реакций на изменение внешней среды.

Анаболизм - совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки.

Катаболизм - совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией.

Схема изучения метаболизма – этапы:

1. Начальный (периферический) метаболизм – проникновение веществ в клетку извне и распад до промежуточных продуктов.

2. Амфиболизм (промежуточный метаболизм) – образование промежуточных продуктов метаболизма, общих для катаболических и анаболических путей.

3. Конечные, строго специализированные этапы конструктивного метаболизма (ведут к построению структур клетки) и энергетического метаболизма (образование АТФ).

Механизмы проникновения питательных веществ в клетку:

Простая диффузия (для истинных растворов). Энергонезависимый процесс.

Облегченная диффузия («паром по течению») – в направлении градиента концентрации с участием белков – переносчиков. Энергозависимый процесс.

Активный транспорт – против концентрационного и электрохимического градиента с участием пермеаз (амино-, оксикислотных, ионных и др.). Процесс идет с затратой энергии АТФ, зависит от заряда веществ и их трансформации в процессе переноса.

Микроорганизмы по способности усваивать источники углерода делятся на две группы: автотрофы (лат. autos - сам,trophe - питание) синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО 2 как единственного источника углерода и гетеротрофы (лат.heteros - другой, «питающийся за счет других») используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения.

В зависимости от источников энергии и микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.

В зависимости от используемых доноров электронов бактерии разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов) и органотрофы (используют органические соединения).

Прототрофы - микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония.

Ауксотрофы - микроорганизмы, не способные синтезировать какие-либо органические соединения. Они получают эти соединения в готовом виде из окружающей среды или организма человека.

Ферменты (от греч.fermentum-закваска) -высокоспецифические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках, без которых не возможны жизнь и размножение. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками.

Ферментный состав микроорганизма определяется геномом и является достаточно стабильным признаком. Определение ферментов широко применяется для биохимической идентификации бактерий.

Эндоферменты катализируют метаболизм проходящий внутри клетки.

Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду.

Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в определенных концентрациях.

Индуцибельные ферменты – это ферменты, концентрация которых увеличивается при поступлении соответствующего субстрата.

Ферменты агрессии: гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа (лицитовителлаза), коагулаза, уреаза, аминокислотные декарбоксилазы, дезоксирибонуклеаза.

Культивирование – получение культур микроорганизмов в условиях искусственной питательной среды.

Цели культивирования:

получение чистых культур патогенных микроорганизмов и их идентификация;

накопление биомассы продуцентов БАВ (витаминов, гормонов, аминокислот, антибиотиков и др.);

получение диагностических и профилактических препаратов (вакцин, диагностикумов);

хранение эталонных музейных культур;

в санитарной микробиологии для определения санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов загрязненности окружающей среды.

Культура – популяция микроорганизмов, выращенная на питательной среде.

Чистая культура – популяция одного вида микроорганизмов, выращенная из изолированной колонии на питательной среде.

Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут.

Классификация питательных сред

По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные.

По происхождению: естественные (молоко, картофель), искусственные, полусинтетические, синтетические

По составу: простые (МПА, МПБ, овощи, молоко), сложные (1% глюкозы, 10-20% сыворотки крови, 20-30% асцитической жидкости,5-10% дефибринированной крови).

По назначению:

универсальные - среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА);

специальные - среды, специально приготовленные для получения роста бактерий, которые не растут на универсальных средах;

дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по ферментативной активности;

селективные - среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий;

дифференциально-селективные - среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред;

консервирующие;

обогатительные.

Размножение бактерий на жидких и плотных питательных средах.

Рост координированное воспроизведение всех компонентов бактериальной клетки и увеличение ее биомассы.Размножение – воспроизводство и увеличение количества клеток, приводящее к образованию бактериальной популяции.

Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Скорость размножения зависит от видовой принадлежности, состава питательной среды, рН, температуры, аэрации.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Колонии разных видов отличаются по размерам, форме, консистенции, окраске, характеру краев, характеру поверхности, прозрачности.

Характер роста на жидких питательных средах: пленочный (образованием пленки на поверхности питательной среды), диффузное помутнение, придонный (образование осадка).

Фазы развития бактериальной популяции

Исходная стационарная фаза (~ 1-2 ч.). Число бактерий не увеличивается, клетки не растут.

Лаг-фаза или фаза задержки размножения (~ 2ч.).

Log-фаза - логарифмическая или экспоненциальная фаза (~ 3-5ч). Популяция делится с максимальной скоростью и идет увеличение особей в геометрической прогрессии.

Фаза отрицательного ускорения (~ 2ч.). Связана с истощением лимитирующего метаболита или накоплением токсических продуктов метаболизма.

Стационарная фаза максимума. Количество образующихся и отмирающих клеток одинаково.

Фаза ускоренной гибели (~ 3 ч.).

Логарифмическая фаза гибели (~ 5).

Фаза уменьшения скорости отмирания – остающиеся живые особи переходят в состояние покоя.

Энергетический метаболизм бактерий

Аэробы - микроорганизмы, использующих аэробный (окислительный) тип биологоческого окисления субстратов. Метаболизм аэробов осуществляется только при наличии в среде обитания высокой концентрации свободного кислорода, который выполняет функцию конечного акцептора отнятых от субстрата электронов. Культивирование аэробов осуществляют на средах с полным доступом кислорода воздуха.

Облигатные анаэробы - микроорганизмы, использующая анаэробный тип биологического окисления (брожение). Метаболизм осуществляется только в средах с низким окислительно-востановительным потенциалом при отсутствии кислорода.

Повышение концентрации кислорода в среде ведет к гибели вегетативных форм.

Количество извлекаемой в процессе брожения энергии невелико, поэтому облигатные анаэробы вынуждены сбраживать большое количество субстрата.

Факультативные анаэробы - микроорганизмы, способные извлекать энергию из субстратов аэробным (окислительным) и анаэробным (бродильным) путями биологического окисления. Метаболизм может осуществляться как в условиях полного доступа кислорода в среду, так и в условиях анаэробиоза.

Методы создания анаэробиоза

Физические

посев в столбик сахарного МПА;

кипячение (регенерация) жидких питательных сред с последующим масляным покрытием;

механическое удаление кислорода в анаэростатах;

замена кислорода индиферентным газом;

трубки Вейона-Виньяля.

Химические

аппарат Аристовского;

свеча Омелянского (щелочной р-р пирогаллола);

использование химических акцепторов кислорода: глюкозы, пировиноградной кислоты, муравьинокислого натрия и др.

Биологические

среда Китта-Тароцци

метод Фортнера

Анаэробы - организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования , конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими .

Анаэробное дыхание - совокупностьбиохимических реакций , протекающих в клетках живых организмов при использовании в качестве конечного акцептора протонов некислорода , а других веществ (например,нитратов ) и относится к процессамэнергетического обмена (катаболизм ,диссимиляция ), которые характеризуютсяокислением углеводов ,липидов иаминокислот до низкомолекулярных соединений.

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O2:

1. Облигатные аэробные (нуждающихся в кислороде) бактерии в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода. (Исключение: микобактерии - рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны.)

2. Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста). 3.Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O 2 не зависят. 4. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум - малая концентрация кислорода. 5.Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке.

Для измеренияпотенциала средыМ. Кларк предложил использовать величину pH20 - отрицательныйлогарифм парциального давления газообразноговодорода . Диапазон характеризует все степени насыщения водного раствора водородом и кислородом. Аэробы растут при более высоком потенциале , факультативные анаэробы , а облигатные - при наиболее низком .)

Классификация анаэробов , различают:

Факультативные анаэробы

Капнеистические анаэробы и микроаэрофилы

Аэротолерантные анаэробы

Умеренно-строгие анаэробы

Облигатные анаэробы

Если организм способен переключаться с одного метаболического пути на другой (например, с анаэробного дыхания на аэробное и обратно), то его условно относят к факультативным анаэробам .

До 1991 года в микробиологии выделяли класс капнеистических анаэробов, требовавших пониженной концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислоты (Бруцеллы бычьего типа - B. abortus)

Это основной метод, используемый при лабораторной ди­агностике инфекционных заболеваний. Сущность бактериологи­ческого метода исследования – посев патологического материа­ла от больных и выделение чистой культуры возбудителя с по­следующей идентификацией его по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным приз­накам.

Метод выделения чистых культур, позволяющий изолиро­вать отдельные виды микробов из той или иной естественной среды их обитания, является важнейшим методом микробиоло­гического исследования. Первым, кто предложил метод выделения чистой культуры, был Л. Пастер.

Способ Пастера, основанный на применении жидких пита­тельных сред, обеспечивал выделение чистой культуры преиму­щественно из материала, содержащего один вид микроба (например, из крови при септицемии и др.). Он был менее эффек­тивен в тех случаях, когда необходимо было изолировать от­дельные виды микроорганизмов из их смеси. Между тем, в есте­ственных условиях материал для бактериологического исследования (мокрота, гной, почва, вода и др.) чаще всего содержит смесь разнообразных микроорганизмов.

Успешное выделение бактериальных смесей и изолирован­ное изучение отдельных видов стало возможным благодаря усо­вершенствованию метода выделения чистых культур Робертом Кохом (R. Косh), применившим для этой цели в 1881 годуплот­ные питательные среды, на которых при посеве удается распре­делить материал таким образом, что отдельные микробные клет­ки располагаются изолированно друг от друга. При соответ­ствующих условиях (питательная среда, оптимальная температу­ра) размножение изолированных клеток дает потомство одного и того же вида, т.е. чистую культуру данного вида микробов .

Через известный период (чаще всего через сутки) на тех мес­тах плотной питательной среды, на которых оказались изолиро­ванные клетки, образуются популяции размножившихся микро­бов – так называемыеколонии, видимые невооруженным гла­зом. Они не представляют собой хаотического скопления микро­бов, о чем можно судить уже по тому, что для многих видов мик­робов колонии имеют характерную структуру, в силу чего можно ориентировочно определить флору исследуемого материала и выбрать те колонии, которые подлежат дальнейшему изучению. Пересев таких колоний на соответствующую питательную среду и представляет собой выделение чистой культуры.

Выделение чистых культур с последующей их идентифика­цией имеет первостепенное значение в диагностике инфекцион­ных заболеваний, обеспечивая быстрое их распознавание, свое­временное лечение и профилактику. Оно не менее важно в определении микрофлоры при исследовании санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (воздух, вода, почва и т.д.), а также при выполнении научных исследований.

В настоящее время имеются многочисленные методы выде­ления чистых культур. Некоторые из них используются ограни­ченно, другие находят широкое применение. Наиболее универ­сальными являются излагаемые ниже методы выделения чистых культур бактерий (метод Дригальского). В то время как другие микроорганизмы – спирохеты, простейшие – требуют применения специальных методов выделения или совсем не могут быть выделены на искусственных питательных средах (некоторые простейшие, риккетсии, вирусы).

Методы выделения чистых культур из микробных смесей принято делить на две основные группы: методы, основанные на принципе механического разобщения микробов в питательной среде, и методы, основанные на использовании биологических свойств микробов. Первая группа включает методы изолирова­ния отдельных клеток: 1) в глубине питательной среды; 2) на поверхности среды и 3) под контролем глаза. Во второй группе ис­пользуют такие свойства микробов, как их подвижность, отно­шение к температуре, кислороду и их патогенные свойства.

Техника посева и пересева

Посевом в микробиологической практике называют внесе­ние в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для обнаружения микроорганизмов.

Пересев – это перенос выращенных микроорганизмов в стерильную среду. Посевы и пересевы микробов являются одним из наиболее распространенных приемов в микробиологической практике.

Пересевы производят так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха или с поверхности окружающих предметов посторонние микроорганизмы. Для этого необходимо строго со­блюдать следующие приемы:

1) посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуют петли, пинце­ты, ватные пробки, края пробирок;

2) в левую руку берут одну пробирку с пересеваемой куль­турой, другую (со стерильной питательной средой) дер­жат в наклонном положении между большим и указа­тельным пальцами;

3) петлю держат в вертикальном положении над пламенем горелки и прокаливают ее металлическую часть докрас­на, а затем наклоняют горизонтально и стерилизуют держатель петли;

4) вынимают ватные пробки и держат их безымянным пальцем и мизинцем правой руки; класть пробки на стол или на какой-нибудь предмет не рекомендуется;

5) обжигают края обеих пробирок;

6) вносят петлю в пробирку с пересеваемой культурой осторожно, не касаясь стенок, захватывают каплю жид­кости или небольшое количество налета на твердой среде и переносят, стараясь не задеть стенок, во вторую про­бирку с обеспложенной питательной средой;

7) петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок. Если ватная пробка загорится, то ею за­крывают пробирку, а наружный конец гасят рукой или пинцетом;

8) петлю вновь обжигают в пламени, на пробирке делают соответствующую надпись: название культуры и дату по­сева.

Посев в жидкую среду можно производить пастеровской или градуированной пипеткой. При использовании пастеровской пипетки обожженным пинцетом следует надломить запаянный конец и слегка обжечь всю пипетку. Пробирку с исследуемой культурой помещают в левую руку, а пипетку – в правую между большим и средним пальцами, зажав ее верхнее отверстие указа­тельным пальцем.

Вынув ватную пробку из пробирки, обжигают края послед­ней. Осторожно опускают пипетку в пробирку и снимают указа­тельный палец. Затем закрывают указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынимают ее из пробирки. Ватную пробку и края пробирки, перед тем как закрыть, обжигают. Исследуемый материал переносят в жидкую среду. После по­сева пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев на плотные среды. При посеве на косой агар наносят прямой или зигзагообразный штрих. Для этого петлю с засе­ваемым материалом вводят в пробирку до скопившейся на дне конденсационной воды и осторожно, не взрыхляя агар, наносят штрих. Сплошной посев получают при размазывании посевного материала по всей поверхности косого агара.

На плотной среде в чашке Петри посев производят следую­щим образом. Питательную среду в пробирках расплавляют на кипящей водяной бане, охлаждают до 48-50°С и разливают ров­ным слоем высотой 3-5 мм в стерильные чашки. Застывшую среду подсушивают в термостате в закрытых чашках в течение 20-30 минут. Открытые чашки кладут вверх дном на полки тер­мостата, покрытые стерильной бумагой. Рядом с чашками по­мещают крышки. При подсушивании с поверхности питательной среды и внутренней поверхности чашек испаряется конденсаци­онная вода. Посев делают петлей в виде параллельных штрихов или стеклянным шпателем.

При определении вида микроба и для выращивания ана­эробов производятпосев уколом в столбик агара или желатина. Для этого пробирку переворачивают кверху дном и длинной прямой иглой с посевным материалом прокалывают столбик среды сверху вниз до самого дна. Затем иглу осторожно вынимают и пробирку закрывают обожженной ватной пробкой. Если необходимы особые меры предосторожности против инфицирования, посевы ведут в специальном шкафу для пересева чистых культур. Засеянные пробирки и чашки Петри помещают в термостат для выращивания.

Микроорганизмы и споры, находящиеся внутри питатель­ных сред или на их поверхности, не могут передвигаться, а оста­ются в том месте, где они находились в момент застывания. Каж­дая клетка или спора начинает размножаться и через 2-3 дня образуетколонию – огромное количество клеток одного вида. Если колония образовалась из одной клетки, то это будет чистая культура того микроорганизма, из клетки которого она выросла.

Выросшие колонии просматривают сначала невооруженным глазом, а затем с помощью лупы или под микроскопом. При этом нельзя не заметить, что колонии отличаются по внеш­нему виду, окраске, строению и т.д.

Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.

В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.

К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:

• взятие материала до начала этиотропного лечения;
• соблюдение условий стерильности при сборе материала;
• техническую правильность сбора материала;
• достаточное количество материала;
• обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
• сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.

Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.

Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.

Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.

Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.

Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.

Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.

Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.

Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).

Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.

Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.

Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.

Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.

Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.

Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.

Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.

Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.

Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.